摘要：目的揭示多花黄精遗传多样性及地理分布特征。方法采用ISSR分子标记技术，对来自浙江、安徽、江西、福建、湖南、湖北6省20个种源株多花黄精进行综合分析。结果16条引物共扩增出条清晰条带，其中多态性条带条，平均多态百分率（PPL）为94.62%，种源内遗传多样性在33.85%～60.00%，平均Nei’s基因多样度（He）为0.，Shannon信息指数（I）为0.，遗传分化系数（Gst）为0.。UPGMA聚类分析显示，同一种源的种质基本上聚在一起，说明种源间的遗传分化大于种源内不同个体间的基因遗传分化；在遗传相似系数值等于0.61时可将份种质聚为武夷山脉、武陵山脉和罗霄山脉、大别山脉、洞宫山脉和天目山脉4类。结论多花黄精具有丰富的遗传多样性，遗传变异与山脉密切相关，山脉之间的平原、水域隔离可能是导致群体间遗传分化的主要原因之一。研究结果对黄精种质资源保护、品种选育具有重要的理论价值与现实意义。

黄精始载于《神农本草经》，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效，具有广阔的开发应用前景[1-4]。多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua是《中国药典》年版药材黄精的基原植物之一，主要分布于浙江、江苏、安徽、江西、福建、湖南、湖北等省，研究其遗传多样性与遗传变异规律，对黄精种质资源保护、品种选育具有重要的理论价值与现实意义。ISSR（inter-simplesequencerepeat）自年由Zietkiewicz创建以来，因可揭示出比限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、微卫星DNA（SSR）更多的多态性而被广泛应用于植物种质资源鉴定、进化与亲缘关系分析、遗传多样性与居群遗传结构检测、遗传作图、基因定位、分子标记辅助育种等方面研究[5-6]。近年来，分子标记技术在黄精属PolygonatumMill.植物的种源鉴定、遗传多样性分析、亲缘关系等方面的研究中得到了广泛应用[7-12]，但对多花黄精主要分布区种质资源遗传多样性与地理变异规律研究未见报道。为此，本实验基于ISSR分子标记技术，对采自安徽、江西、福建、湖南、湖北及浙江6省20个种源多花黄精遗传多样性和遗传变异规律进行了综合分析。

1材料

年8月至年12月，对安徽、江西、湖南、湖北、福建、浙江、云南、重庆、贵州等16个省“黄精”资源进行调查与收集，每个种源采集15个单株以上，采样单株间隔5m以上，并详细记录采集地的海拔、经纬度、植被等样品采集信息[13]，种质资源统一种植于杭州市临安区天目山镇横塘村麻泥角弄浙江农林大学黄精种质资源圃。经斯金平教授鉴定采自安徽、江西、福建、湖南、湖北、浙江6个省20个种源地的种质为多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua，样品信息见表1。ISSR材料为采自黄精种质资源圃的新鲜叶片，DNA提取前用冰盒保存，置于实验室?20℃冰箱里保存备用。

2方法

2.1DNA提取

将保存于?20℃的多花黄精叶片，在液氮中研磨至细粉末状，利用改良的CTAB法提取DNA[14]，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。将DNA稀释至10ng/μL，置于?20℃冰箱保存备用。

2.2PCR扩增及引物筛选

参照加拿大哥伦比亚大学UBC公司公布的条ISSR引物序列，从中筛选出16个扩增条带多、稳定性好、多态性强、背景清晰的引物，引物序列见表2，用于正式扩增。

以1×TAE为缓冲液，取5μLPCR产物用1%的琼脂糖凝胶于V电压下电泳30min，再用凝胶成像分析系统对其观测、拍照。

2.3数据统计与分析

按照相同迁移位上有条带记为“1”，反之记为“0”，模糊不清或无法准确标记的条带忽略不计数的方法构建0/1矩阵。利用POPGENE32.0软件对全部群体和各单个群体分别进行遗传参数分析，观测点等位基因数（Na）、多态位点比率（PPL）、Shannon信息指数（I）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性指数（He）、多态性位点数（K）、Nei’s基因分化指数（Gst）、基因流（Nm）等遗传参数分析。基于遗传相似系数，利用NTSYSPC2.10e软件对多花黄精20个种源地个样品进行不加权成对算术平均法（UPGMA）聚类分析。

3结果与分析

3.1ISSR扩增结果及多态性分析

利用筛选的16条ISSR引物对20个种源的份多花黄精样品进行PCR扩增，部分扩增结果见图1。共检测到个位点，其中多态性位点共个，多态性比率为94.62%；16条ISSR引物扩增出5～13条数目不等的条带，平均每条引物扩增8.13条带；引物UBC扩增的条带数最多为13条；UBC扩增的条带数最少，只有5条；16条引物扩增平均多态性条带为7.69条，多态性比率在71.42%～.00%，有10条引物的多态性比率达到%，引物UBC多态性比率最低为71.42%，扩增情况见表3。

3.2遗传多样性分析

将筛选出来的16条引物所得的扩增结果进行“0/1”赋值，转换成二元矩阵，使用Popgene32进行统计分析，所得结果列于表4。

从表4可见，多花黄精种源间的ISSR遗传多样性差异较大，各种源的多态位点比率（PPL）在33.85%～60.00%，平均为48.54%，PPL由高到低的顺序为JX-LHS＝ZJ-JN＞AH-JZ＝ZJ-QY＞AH-HS＞ZJ-LA＞ZJ-LQ＞ZJ-TS＝JX-PX＞FJ-TN＞JX-XS＞ZJ-AJ＞HB-CY＞ZJ-SX＞HN-GZ＞ZJ-JD＞ZJ-PA＞ZJ-YJ＞ZJ-FH＞ZJ-SZ。其中江西鹰潭龙虎山（JX-LHS）与浙江丽水景宁（ZJ-JN）种源内的多态位点比率最高为60.00%，其次是安徽六安金寨（AH-JZ）与浙江丽水庆元（ZJ-QY）种源内多态性比率为57.69%，浙江绍兴嵊州（ZJ-SZ）的PPL最低为33.85%，20个种源的平均PPL为48.54%，小于物种多态性位点比率94.62%。20个种源的Na在1.～1.，平均值为1.；Ne在1.～1.，平均值为1.；He在0.～0.，平均值为0.；I在0.～0.，平均值为0.。

多花黄精总的基因多样度（Ht）为0.，各种源内的基因多样度（Hs）为0.，群体间的基因多样度（Dst，Dst＝Ht－Hs）为0.，Gst为0.，这表明多花黄精种源内和种源间均有一定的遗传分化。6个省的多花黄精种源Nm为0.，说明了不同种源间的基因流动程度较低，遗传背景较单纯。

3.3群体的遗传距离及聚类分析

采用NTsys-pc2.10软件对20个多花黄精种群的遗传关系按UPGMA建立聚类分析树状图（图2），从图可知，同一种源的多花黄精基本上聚在一起，说明种源间的遗传分化大于种源内不同个体间的基因遗传分化，遗传相似系数值为0.61时，份种质分为4类。聚类具有明显的地域特征，与山脉密切相关（图3），山脉之间的平原、水域隔离可能是导致群体a间遗传分化的主要原因之一。

第I类为武夷山脉的种质，包括武夷山脉西段的江西九江龙虎山种源，武夷山脉中段西南麓的福建泰宁县种源。第II为武陵山脉与罗霄山脉的种质，遗传相似系数值为0.65时可分为2组，第1组为来自武陵山脉古丈和长阳的10个种质；第2组为来自罗霄山脉江西萍乡和修水的10个种质。第III类为大别山脉安徽六安金寨的种质，位于多花黄精分布区北缘。第IV类洞宫山脉和天目山脉及浙东低山区的种质。在遗传相似系数值0.63时分为2组，第1组包括天目山脉及浙东低山区的安吉、奉化、嵊州、绍兴、临安、永嘉、磐安、建德和安徽黄山的53个种质。第2组为洞宫山脉的包括泰顺、庆元、景宁和龙泉的27个种质。

4讨论

通过对浙江、安徽、江西、湖北、湖南、福建6个省多花黄精主产区20个种源份种质进行ISSR分析，16条引物共扩增出条清晰条带，其中多态性条带条，PPL为94.62%，种源内的PPL为33.85%～60.00%，平均48.54%。自然分布范围广的物种通常趋向于具有更高的遗传多样性，反之则具有相对较低的遗传多样性[15]，多花黄精分布区域较广，各地气候、土壤、环境类型多样，也就形成了其丰富的遗传多样性；对黄精属植物分类及系统学研究结果表明，各类群间性状交叉，地理分布区重叠，新的变异型不断发现，预示该属植物仍处于较活跃的分化阶段[16]，这可能也是多花黄精遗传多样性丰富的原因之一。多花黄精种源间的Dst为0.，Gst为0.，Nm为0.，表明多花黄精种源间具有较大程度的遗传分化，不同种源间的基因流动程度较低。由于多花黄精主要分布于～2m的生林、灌丛或山坡阴处[17]，种源间存在不适生境阻隔，限制了基因交流，从而使得种源间遗传分化程度越来越高，地理隔离造成的较低的基因流动可能是多花黄精遗传分化产生的重要原因。

对20个多花黄精种群的遗传关系按UPGMA建立聚类分析树状图（图2）表明，同一种源的种质基本上都聚在一起，地理位置相近的种源样品也能相邻而聚，种源间的遗传分化大于种源内不同个体间的基因遗传分化。从聚类图中可以看出在遗传相似系数值等于0.61时可将份种质聚为以下4类：第I类为武夷山脉的2个种源12个种质，第II为武陵山脉和罗霄山脉的4个种源20份种质，第III类为大别山安徽六安金寨种源7份种质，第IV类洞宫山脉和天目山脉及浙东低山区的13个种源80份种质，多花黄精的遗传变异与山脉密切相关。由于多花黄精主要分布于山地，种源间存在平原与水域的隔离，使得空间距离较远，影响花粉和种子的传播，减弱基因的交流；不同山脉各自的气候特征、地形、土壤和水热等生态环境均有差异，从而形成不同的生境，在环境压力的作用下，居群之间也就形成了稳定的遗传变异，推测山脉之间的平原、水域隔离可能是导致群体间遗传分化的主要原因之一。

参考文献（略）

来源：刘新，斯金平，段承俐，刘京晶.多花黄精遗传多样性和遗传变异规律研究[J].中草药,,51(10):-.